پروٹین اور ان کی ساخت اور کام کی بنیاد پر، سالماتی سطح پر زندگی کے مظاہر کو سمجھنا جدید حیاتیات کی ترقی کا بنیادی رخ بن گیا ہے۔ پروٹین کا مطالعہ کرنے کے لیے، ہمیں سب سے پہلے انتہائی پاکیزہ اور حیاتیاتی طور پر فعال ہدف والے مادوں کو حاصل کرنا ہوگا۔ پروٹین کی تیاری میں فزکس، کیمسٹری اور بیالوجی کے مختلف پہلو شامل ہوتے ہیں لیکن بنیادی اصول دو پہلوؤں سے زیادہ کچھ نہیں۔ ایک یہ ہے کہ مرکب میں کئی اجزاء کی تقسیم کی شرح میں فرق کو دو یا کئی مرحلوں میں تقسیم کرنے کے لیے استعمال کیا جائے جنہیں مکینیکل طریقوں سے الگ کیا جا سکتا ہے، جیسے نمکین نکالنا، نامیاتی سالوینٹ نکالنا، کرومیٹوگرافی اور کرسٹلائزیشن وغیرہ۔ دوسرا یہ ہے کہ مرکب کو ایک ہی مرحلے میں رکھا جاتا ہے، اور اجزاء کو الگ کرنے کے مقاصد، جیسے الیکٹروفورسس، الٹرا سینٹرفیوگریشن، الٹرا فلٹریشن، وغیرہ کے حصول کے لیے فزیکل فورس فیلڈز کے عمل کے ذریعے ایک ہی علاقے میں تقسیم کیا جاتا ہے۔ حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کی سالمیت کو برقرار رکھنے اور تیزاب، الکلیس، اعلی درجہ حرارت اور شدید میکانکی اثرات کی وجہ سے مجوزہ مادوں کی حیاتیاتی سرگرمی کے نقصان کو روکنے کے لیے طریقوں کا خیال رکھنا چاہیے۔ پروٹین کی تیاری کو عام طور پر مندرجہ ذیل چار مراحل میں تقسیم کیا جاتا ہے: مواد کا انتخاب اور پریٹریٹمنٹ، سیل میں خلل اور آرگنیل کی علیحدگی، نکالنا اور صاف کرنا، ارتکاز، خشک کرنا اور تحفظ۔ مائکروجنزم، پودوں اور جانوروں کو پروٹین کی تیاری کے لیے خام مال کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے، اور منتخب کردہ مواد بنیادی طور پر تجربے کے مقصد کی بنیاد پر طے کیے جاتے ہیں۔ مائکروجنزموں کے لئے، ان کی ترقی کے مرحلے پر توجہ دینا چاہئے. مائکروجنزموں کے لوگاریتھمک نمو کے مرحلے میں، انزائمز اور نیوکلک ایسڈز کا مواد زیادہ ہوتا ہے، اور اعلیٰ پیداوار حاصل کی جا سکتی ہے۔ مائکروجنزموں کو مواد کے طور پر استعمال کرتے وقت دو صورتیں ہوتی ہیں: (1) مائکروبیل سیل کی رطوبت کو کلچر میڈیم میں میٹابولائٹس اور ایکسٹرا سیلولر انزائمز کا استعمال کرنا چاہیے۔ (2) بیکٹیریا میں موجود حیاتیاتی کیمیائی مادوں کا استعمال کریں، جیسے کہ پروٹین، نیوکلک ایسڈ اور انٹرا سیلولر انزائمز۔ پودوں کے مواد کو شیلڈ اور ڈیفیٹ کیا جانا چاہیے، اور پودوں کی مختلف اقسام اور نشوونما اور نشوونما کے حالات پر توجہ دی جانی چاہیے۔ ان میں موجود حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کی مقدار بہت مختلف ہوتی ہے، اور اس کا موسمی نوعیت سے گہرا تعلق ہے۔ جانوروں کے بافتوں کے لیے، فعال اجزاء سے بھرپور اعضاء کے ٹشوز کو خام مال کے طور پر منتخب کیا جانا چاہیے، اور انہیں پہلے کیما بنایا جانا چاہیے۔ اس کے علاوہ، پہلے سے علاج شدہ مواد کو منجمد اور ذخیرہ کیا جانا چاہیے اگر وہ فوری طور پر تجربات کے لیے استعمال نہ کیے جائیں، اور تازہ مواد کو بائیو میکرو مالیکیول تیار کرنے کے لیے استعمال کیا جانا چاہیے جو آسانی سے گل جاتے ہیں۔ پروٹین کی علیحدگی اور تطہیر 1. پروٹین کا اخراج (بشمول خامروں) زیادہ تر پروٹین پانی میں حل پذیر ہوتے ہیں، نمک کو پتلا کرتے ہیں، تیزاب یا الکلی محلول میں حل ہوتے ہیں، جب کہ لپڈز کے پابند پروٹین کی ایک چھوٹی سی تعداد نامیاتی سالوینٹس جیسے ایتھنول، ایسیٹون، میں حل ہوتی ہے۔ butanol اور اسی طرح. لہذا، پروٹین اور خامروں کو نکالنے، الگ کرنے اور صاف کرنے کے لیے مختلف سالوینٹس کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ (1) آبی محلول نکالنے کا طریقہ۔ پتلا نمک اور بفر سسٹم کے آبی محلول میں پروٹین کے لیے اچھی استحکام اور اعلی حل پذیری ہوتی ہے۔ یہ پروٹین نکالنے کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والا سالوینٹ ہے۔ معمول کی خوراک خام مال کے حجم سے 1-5 گنا ہے۔ پروٹین کی تحلیل کی سہولت کے لیے نکالنے کے دوران یکساں ہلچل کی ضرورت ہوتی ہے۔ نکالنے کا درجہ حرارت فعال اجزاء کی خصوصیات پر منحصر ہے۔ ایک طرف، زیادہ تر پروٹینوں کی حل پذیری درجہ حرارت کے ساتھ بڑھ جاتی ہے۔ لہذا، اعلی درجہ حرارت تحلیل کے لئے سازگار ہے اور نکالنے کے وقت کو کم کرتا ہے۔ لیکن دوسری طرف، بڑھتے ہوئے درجہ حرارت سے پروٹین کو ناکارہ اور غیر فعال کر دے گا۔ لہذا، اس غور کی بنیاد پر، کم درجہ حرارت (5 ڈگری سے نیچے) آپریشن عام طور پر پروٹین اور انزائمز نکالتے وقت استعمال کیے جاتے ہیں۔ پروٹین نکالنے کے دوران انحطاط سے بچنے کے لیے، پروٹولیٹک انزائم انحیبیٹرز (جیسے ڈائی سوپروپیل فلورو فاسفیٹ، آئوڈوسیٹک ایسڈ وغیرہ) شامل کیے جا سکتے ہیں۔
ارتکاز، خشک کرنا اور محفوظ کرنا 1. نمونوں کا ارتکاز حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کی تیاری کے عمل کے دوران، کالم صاف کرنے کی وجہ سے نمونے بہت پتلے ہو جاتے ہیں۔ تحفظ اور شناخت کے مقصد کے لیے اکثر ارتکاز کی ضرورت ہوتی ہے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے ارتکاز کے طریقے: 1. ڈیکمپریشن اور حرارتی بخارات کا ارتکاز مائع کی سطح کے دباؤ کو کم کرکے مائع کے ابلتے نقطہ کو کم کرتا ہے۔ ڈیکمپریشن کی ویکیوم ڈگری جتنی زیادہ ہوگی، مائع کے قطروں کا ابلتا نقطہ اتنا ہی کم ہوگا اور یہ اتنی ہی تیزی سے بخارات بنتا ہے۔ یہ طریقہ کچھ ایسے مریضوں کے لیے موزوں ہے جو گرم حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کی عدم برداشت کا شکار ہیں۔ 2. ہوا کا بہاؤ بخارات بن کر مرتکز ہو جاتا ہے۔ ہوا کا بہاؤ مائع کے بخارات کو تیز کر سکتا ہے، اور محلول کو ایک پتلی پرت میں پھیلا سکتا ہے، ہوا کا بہاؤ مسلسل سطح سے گزرتا رہتا ہے۔ یا بائیولوجیکل میکرومولیکول محلول کو ڈائیلاسز بیگ میں ڈالیں اور اسے ٹھنڈے کمرے میں رکھیں، اور ہوا کو اڑانے کے لیے پنکھے کا استعمال کریں۔ ارتکاز کے مقصد کو حاصل کرنے کے لیے جھلی سے گزرنے والا سالوینٹ بخارات نہیں بنتا۔ اس طریقہ کار میں ارتکاز کی رفتار سست ہے اور یہ حل کی ایک بڑی مقدار کو مرکوز کرنے کے لیے موزوں نہیں ہے۔ 3. منجمد کرنے کا طریقہ: حیاتیاتی میکرو مالیکیول کم درجہ حرارت پر برف میں جم جاتے ہیں۔ نمکیات اور حیاتیاتی میکرو مالیکیول برف میں داخل نہیں ہوتے لیکن مائع مرحلے میں رہتے ہیں۔ آپریشن کے دوران، مرتکز ہونے والے محلول کو پہلے ٹھنڈا کیا جاتا ہے تاکہ اسے ٹھوس میں تبدیل کیا جا سکے، اور پھر آہستہ آہستہ پگھل جائے۔ سالوینٹس اور محلول کے پگھلنے والے مقامات کے درمیان فرق زیادہ تر سالوینٹس کو ہٹانے کے مقصد کو حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ مثال کے طور پر، جب پروٹین اور انزائم کے نمک کے محلول کو اس طریقے سے مرتکز کیا جاتا ہے، تو بغیر پروٹین اور انزائم کے خالص برف کے کرسٹل مائع کی سطح پر تیرتے ہیں، اور پروٹین اور انزائم نچلے محلول میں مرتکز ہوتے ہیں۔ اوپری آئس کیوبز کو ہٹا کر، پروٹین اور انزائم کا ارتکاز حاصل کیا جا سکتا ہے۔ مائع 4. جذب کرنے کا طریقہ: محلول میں محلول کے مالیکیولز براہ راست جاذب کے ذریعے جمع کیے جاتے ہیں تاکہ اسے مرتکز کیا جا سکے۔ استعمال شدہ جاذب کو محلول کے ساتھ کیمیائی طور پر رد عمل ظاہر نہیں کرنا چاہیے، حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کو جذب نہیں کرنا چاہیے، اور محلول سے آسانی سے الگ ہونا چاہیے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے جاذب میں پولیتھیلین گلائکول، پولی وینیل پائرولائڈون، سوکروز اور جیل شامل ہیں۔ پولی تھیلین گلائکول جذب کرنے والے استعمال کرتے وقت، سب سے پہلے حیاتیاتی میکرومولیکول محلول کو نیم پارگمیبل جھلی کے تھیلے میں ڈالیں، اور پولی تھیلین گلائکول شامل کریں۔ جب اسے الکحل سے ڈھانپ کر 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر رکھا جاتا ہے، تو تھیلی سے نکلنے والا سالوینٹس پولی تھیلین گلائکول کے ذریعے تیزی سے جذب ہو جائے گا۔ پولی تھیلین گلائکول پانی سے سیر ہونے کے بعد، جب تک مطلوبہ حجم تک نہ پہنچ جائے اسے نئے سے تبدیل کرنا چاہیے۔ 5. الٹرا فلٹریشن الٹرا فلٹریشن ایک ایسا طریقہ ہے جو محلول میں مختلف محلول مالیکیولز کو منتخب طور پر فلٹر کرنے کے لیے ایک خاص جھلی کا استعمال کرتا ہے۔ جب مائع ایک خاص دباؤ (نائٹروجن پریشر یا ویکیوم پمپ پریشر) کے تحت جھلی سے گزرتا ہے، تو سالوینٹس اور چھوٹے مالیکیولز کے ذریعے، میکرو مالیکیولز کو روک کر برقرار رکھا جاتا ہے۔ یہ حالیہ برسوں میں تیار کردہ ایک نیا طریقہ ہے۔ یہ حیاتیاتی میکرو مالیکیولز، خاص طور پر پروٹین اور انزائمز کے ارتکاز یا صاف کرنے کے لیے موزوں ترین ہے۔ اس میں کم لاگت، آسان آپریشن، ہلکے حالات ہیں، اور اسے بہتر طریقے سے برقرار رکھا جا سکتا ہے اس میں حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کی اعلی سرگرمی اور بحالی کی اعلی شرح کے فوائد ہیں۔ الٹرا فلٹریشن کو لاگو کرنے کی کلید جھلیوں کا انتخاب ہے۔ جھلیوں کی مختلف اقسام اور خصوصیات میں مختلف پیرامیٹرز ہوتے ہیں جیسے پانی کے بہاؤ کی شرح اور مالیکیولر ویٹ کٹ آف ویلیو (یعنی مالیکیولز کی کم از کم مالیکیولر ویٹ ویلیو جسے جھلی کے ذریعے برقرار رکھا جا سکتا ہے)، اور کام کی ضروریات کے مطابق منتخب کیا جانا چاہیے۔ اس کے علاوہ، الٹرا فلٹریشن ڈیوائس کی شکل، محلول کی ساخت اور خصوصیات، محلول کا ارتکاز، وغیرہ سب کا الٹرا فلٹریشن اثر پر ایک خاص اثر پڑتا ہے۔ کھوکھلی فائبر ٹیوبیں الٹرا فلٹریشن جھلیوں سے بنتی ہیں، اور ایسی بہت سی ٹیوبیں ایک بنڈل میں جمع ہوتی ہیں۔ ٹیوبوں کے دونوں سرے کم آئنک طاقت والے بفر سے جڑے ہوتے ہیں تاکہ بفر ٹیوب میں مسلسل بہتا رہے۔ اس کے بعد فائبر ٹیوب کو پروٹین کے محلول میں ڈبو دیا جاتا ہے تاکہ ڈائلائز کیا جائے۔ جب بفر فائبر ٹیوب سے گزرتا ہے، تو چھوٹے مالیکیول آسانی سے جھلی کے ذریعے پھیل سکتے ہیں، لیکن بڑے مالیکیول نہیں کر سکتے۔ یہ فائبر فلٹریشن ڈائلیسس کا طریقہ ہے۔ ڈائیلاسز کے علاقے میں اضافے کی وجہ سے، ڈائیلاسز کا وقت 10 گنا کم کر دیا گیا ہے۔ 2. خشک کرنا: خرابی کو روکنے اور ذخیرہ کرنے کی سہولت کے لیے، حیاتیاتی میکرو مالیکیولز سے تیار کردہ مصنوعات کو اکثر خشک کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ سب سے زیادہ استعمال شدہ طریقے منجمد خشک کرنے اور ویکیوم خشک کرنے والے ہیں۔ ویکیوم ڈرائینگ ان مادوں کو خشک کرنے اور محفوظ کرنے کے لیے موزوں ہے جو زیادہ درجہ حرارت کے خلاف مزاحم نہیں ہیں اور آکسیڈیشن کا شکار ہیں۔ ڈرائر، کنڈینسر اور ویکیوم خشک کرنے والے اصول کے علاوہ، پورا آلہ درجہ حرارت کا عنصر بھی شامل کرتا ہے۔ اسی دباؤ کے تحت، درجہ حرارت میں کمی کے ساتھ پانی کے بخارات کا دباؤ کم ہو جاتا ہے، لہٰذا کم درجہ حرارت اور کم دباؤ پر، برف آسانی سے گیس میں تبدیل ہو جاتی ہے۔ آپریشن کے دوران، خشک ہونے والے مائع کو عام طور پر پہلے نقطہ انجماد کے نیچے جما دیا جاتا ہے تاکہ اسے ٹھوس میں تبدیل کیا جا سکے، اور پھر سالوینٹ کو کم درجہ حرارت اور کم دباؤ پر گیس میں تبدیل کر کے ہٹا دیا جاتا ہے۔ اس طریقے سے خشک ہونے والی مصنوعات میں ڈھیلے پن، اچھی حل پذیری، اور قدرتی ساخت کو برقرار رکھنے کے فوائد ہوتے ہیں، اور یہ مختلف حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کو خشک کرنے اور محفوظ کرنے کے لیے موزوں ہیں۔ 3. ذخیرہ حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کا استحکام ذخیرہ کرنے کے طریقہ کار سے گہرا تعلق رکھتا ہے۔ خشک مصنوعات عام طور پر نسبتاً مستحکم ہوتی ہیں، اور کم درجہ حرارت پر ان کی سرگرمی دنوں یا برسوں تک غیر تبدیل شدہ رہ سکتی ہے۔ سٹوریج کے تقاضے سادہ ہیں، جب تک کہ خشک نمونوں کو ڈیسیکیٹر میں رکھا جائے (جس میں ڈیسیکینٹ ہو) اور سیل کر دیا جائے، اور اسے 0-4 پر رکھا جائے جب مائعات کو ذخیرہ کرتے وقت درج ذیل نکات پر دھیان دیا جائے: 1. نمونہ زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔ کمزور۔ اسے پیک کرنے اور ذخیرہ کرنے سے پہلے اسے ایک خاص ارتکاز پر مرکوز کرنا ضروری ہے۔ ایک نمونہ جو بہت زیادہ پتلا ہے آسانی سے حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کو رد کر سکتا ہے۔ 2. عام طور پر، پرزرویٹوز اور سٹیبلائزرز کو شامل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے پرزرویٹوز میں ٹولین، بینزوک ایسڈ، کلوروفارم، تھامول وغیرہ شامل ہیں۔ پروٹین اور انزائمز کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے اسٹیبلائزرز میں امونیم سلفیٹ پیسٹ، سوکروز، گلیسرول وغیرہ شامل ہیں۔ انزائمز کے لیے سبسٹریٹس اور کوئنزائمز بھی ان کے استحکام کو بہتر بنانے کے لیے شامل کیے جا سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، کیلشیم، زنک، اور بورک ایسڈ جیسے محلول بھی بعض خامروں پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتے ہیں۔ نیوکلک ایسڈ میکرو مالیکیولز کو عام طور پر سوڈیم کلورائد یا سوڈیم سائٹریٹ کے معیاری بفر محلول میں محفوظ کیا جاتا ہے۔ 3. سٹوریج کے درجہ حرارت کی ضروریات کم ہیں، زیادہ تر ریفریجریٹرز میں 0 ڈگری کے ارد گرد ذخیرہ کیے جاتے ہیں، اور کچھ کو مختلف مادوں کے لحاظ سے کم درجہ حرارت کی ضرورت ہوتی ہے۔